HPLC vs. LC-MS

HPLC vs. LC-MS: ce spune fiecare metodă despre un peptid

Când compari două loturi de peptide, cifra la care se uită toată lumea este procentul din raportul HPLC. Problema este că acel procent răspunde la o singură întrebare, iar identitatea compusului nu face parte din ea. Aici intervine LC-MS.

Ce măsoară HPLC

HPLC (cromatografie de lichide de înaltă performanță) separă amestecul injectat în componentele sale, în funcție de cât de puternic interacționează fiecare cu coloana. Detectorul UV înregistrează fiecare componentă pe măsură ce iese, iar rezultatul este o cromatogramă cu vârfuri.

Procentul raportat este o valoare de arie: aria vârfului principal raportată la aria totală a vârfurilor detectate. Este o măsură a separării cromatografice, nu o declarație despre ce anume se află în vârful respectiv.

Ce nu îți spune HPLC:

• identitatea moleculei din vârful principal
• masa moleculară a compusului
• prezența unor impurități care nu absorb în UV la lungimea de undă folosită
• dacă secvența peptidică este cea corectă

Ce adaugă LC-MS

LC-MS combină aceeași separare cromatografică cu un spectrometru de masă. După ce componentele sunt separate, sunt ionizate și măsurate în funcție de raportul masă/sarcină.

Rezultatul este o valoare a masei moleculare care poate fi comparată cu masa teoretică a secvenței declarate. Peptidele mai mari apar de obicei ca ioni multiplu încărcați, iar masa se calculează din aceștia.

Masa moleculară observată
M = (m/z × z) − (z × 1.00794)

LC-MS confirmă identitatea. Nu înlocuiește HPLC pentru cuantificare, deoarece răspunsul spectrometrului de masă variază în funcție de compus și nu este proporțional cu cantitatea în același mod ca detecția UV.

Diferența, pe scurt

HPLC răspunde la întrebarea legată de separarea probei și de distribuția vârfurilor. Rezultatul este o cromatogramă și un procent de arie. Metoda nu confirmă identitatea compusului, dar permite o cuantificare relativă.

LC-MS răspunde la întrebarea legată de masa compusului eluat. Rezultatul este un spectru de masă și o masă observată care se compară cu cea teoretică. Metoda confirmă identitatea, dar are utilitate limitată pentru cuantificare.

Cum citești un certificat de analiză

Un dosar analitic complet ar trebui să conțină ambele analize, plus datele care le fac verificabile:

• numărul lotului, care trebuie să corespundă etichetei de pe flacon
• data analizei și laboratorul care a efectuat-o
• cromatograma HPLC integrală, nu doar cifra finală
• spectrul de masă cu masa teoretică și cea observată
• condițiile de analiză, incluzând coloana, faza mobilă și lungimea de undă

Dacă un raport prezintă doar un procent, fără cromatogramă și fără date de masă, informația nu poate fi verificată independent.

De reținut

HPLC și LC-MS nu sunt metode concurente și nici interschimbabile. Prima descrie compoziția probei în termeni de separare, a doua confirmă ce anume a fost separat. Un dosar analitic care le include pe ambele permite verificarea completă a lotului.

Produsele prezentate pe acest site sunt destinate exclusiv utilizării în cercetare de laborator. Nu sunt medicamente și nu sunt destinate consumului uman sau animal, uzului diagnostic ori terapeutic.